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      免疫組化實驗檢測

      產品名稱: 免疫組化實驗檢測
      產品型號:
      產品特點: 信帆生物代做免疫組化實驗,技術穩定,實驗結果可靠。提供技術指導和售后服務,價格實惠!歡迎廣大科研客戶朋友!代測,試劑盒,實驗代測

      免疫組化實驗檢測 的詳細介紹

      免疫組化實驗檢測

      信帆生物代做免疫組化實驗,技術穩定,實驗結果可靠。提供技術指導和售后服務,價格實惠!歡迎廣大科研客戶朋友!代測,試劑盒,!

      主要操作步驟:
      1.        洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數的組織帶負電荷,從而產生吸附作用。
      2.        包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,zui后加入少許液體石蠟,進行冷凍,使石蠟變成固態。
      3.        切片:將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機上,切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向*,然后調節切片的厚度,一般為5&micro;m,如果比較難切,則可以適當調整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
      4.        撈組織:當組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候方向*,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
      5.        脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
      6.        抗原修復:脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
      7.        血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(900&micro;lPBS:100&micro;l血清封閉液)。
      8.        加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過一夜。
      9.        加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
      10.        加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍(990&micro;lPBS:10&micro;lSABC)。
      11.        加顯色劑:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)   A:DAB        B:H2O2        C:磷酸緩沖液
      12.        復染:將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
      13.        脫水:將復染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,zui后浸泡在二甲苯中,搬到通風柜中。
      14.        封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側,然后輕輕放下另一側,以免產生氣泡,封好片子后置于通風柜中晾干。

       

      注意事項:

      切片組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理,由于我們檢測抗原是多種多樣的,因染色操作程序復雜,時間較長,有些抗原是要進行各種抗原修復處理,如微波、高壓、水溶酶等,玻片如果得不到很好的處理,將易造成脫片,為保證實驗的正常進行,要求在貼片前對載玻片作適當處理,必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。
      1)Poly-L-Lysine 
      一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴氨酸,也可用試劑公司出售的其濃溶液以1:10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中,傾盡余液,在60℃溫箱中烤干備用,此方法的優點是可以用于多種組織化學、及分子學檢測中的應用,粘貼效果,但價格稍貴。
      2)明膠硫酸鉻鉀法
      將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中,完全溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min,取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單,任何實驗都可以使用,特別適用于大批量的使用,但應注意,如果液體變藍或粘稠狀停用。
      3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)
      此法必須現用現配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中,浸泡20s,取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷,否則組織片中易出現氣泡。
      切片必須保持切片刀銳利,切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕,如有上述問題的切片在進行染色都將出現假陽性現象,切片厚度一般為3~4μm,切好的切片在60℃溫箱中過一夜,注意烤片的溫度不宜過高,否則易使組織細胞結構破壞,而產生抗原標記定位彌漫現象。

       

       

       

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